应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小窝蛋白1基因的神经细胞构建与功能鉴定

doi:10.11853/j.issn.1003.8280.2018.05.008

中国媒介生物学及控制杂志 ›› 2018, Vol. 29 ›› Issue (5): 453-457.DOI: 10.11853/j.issn.1003.8280.2018.05.008

应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小窝蛋白1基因的神经细胞构建与功能鉴定

权力^1,2, 江爱民^1,3, 卢彦宗^1,2, 朱耐伟¹, 朱勇喆¹

1 第二军医大学微生物学教研室, 上海 200433;
2 第二军医大学学员旅学员1队, 上海 200433;
3 第二军医大学学员旅学员9队, 上海 200433

收稿日期:2018-06-02 出版日期:2018-10-20 发布日期:2018-10-20
通讯作者: 朱勇喆,Email:zhuyongzhe1984@sina.com
作者简介:权力,男,在读博士,主要从事病毒致病机制研究,Email:13340700015@fudan.edu.cn;江爱民,男,在读本科,主要从事病毒致病机制研究,Email:18301935531@163.com
基金资助:
第二军医大学创新能力培养计划（FH2016123，FH2016124）

Constructing and functional analysis of knocking out CAV-1 gene by CRISPR/Cas9 system in neuron cells

QUAN Li^1,2, JIANG Ai-min^1,3, LU Yan-zong^1,2, ZHU Nai-wei¹, ZHU Yong-zhe¹

1 Department of Microbiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;
2 Company1, Cadet's Brigade, Second Military Medical University;
3 Company 9, Cadet's Brigade, Second Military Medical University

Received:2018-06-02 Online:2018-10-20 Published:2018-10-20
Supported by:
Supported by the Innovation Ability Training Program (No. FH2016123, FH2016124)

摘要/Abstract

摘要： 目的利用CRISPR/Cas9基因编辑系统建立小窝蛋白1（CAV-1）基因敲除的神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y），并验证其对流行性乙型脑炎病毒（JEV）的易感性。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则，基于人源CAV-1基因的外显子区（EXON）序列设计小向导RNA（sgRNA），将sgRNA连接到载体PX459质粒上。将重组质粒转染至SH-SY5Y细胞中，使用嘌呤霉素筛选稳定敲除CAV-1蛋白的SH-SY5Y细胞，并用免疫印迹法验证CAV-1蛋白的敲除效果。免疫荧光法比较CAV-1基因敲除的SH-SY5Y株与野生型细胞株对JEV感染性的差异。结果经酶切和测序鉴定，重组真核表达质粒构建正确，转染并筛选的单克隆细胞中没有CAV-1蛋白的表达，成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株。与野生型SH-SY5Y细胞株相比，CAV-1基因敲除的细胞株对JEV的感染性下降约90%（P<0.001）。结论利用CRISPR/Cas9系统成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株，该细胞株可用于进一步研究CAV-1蛋白在JEV感染中的作用机制。

关键词: 基因编辑, 小窝蛋白, 神经细胞, 流行性乙型脑炎病毒

Abstract: Objective To establish a stable CAV-1 gene knockout cell line by CRISPR/Cas9 system in neuroblastoma cell line (SH-SY5Y), and to investigate its function on Japanese encephalitis virus (JEV) infection. Methods The sgRNA sequences targeting EXON of human CAV-1 gene were designed according to the principles of CRISPR/Cas9, and then were cloned into PX459 plasmid.The SH-SY5Y cells transfected with the recombinant plasmids were selected by puromycin to gain the CAV-1 knockout cells. The cells with CAV-1 knockout effect were verified by Western blotting. The differences of JEV infection on CAV-1 knockout cells and wild type cells were detected by immunofluorescence. Results The recombinant plasmids were verified by enzyme cutting and gene sequencing and were successfully constructed. The protein of CAV-1 was undetected in SH-SY5Y cells after transfection and screening of monoclonal cell by puromycin and the CAV-1 knockout SH-SY5Y cells were successfully constructed. Compared to the wild type cells, the infectivity of JEV on the CAV-1 knockout cells decreased by 90% (P<0.001). Conclusion The CAV-1 gene was knocked out successfully by CRISPR/Cas9 system in SH-SY5Y cells. This cell line can be used to further study the mechanism of JEV infection.

Key words: Gene editing, Caveolin, Neuron cells, Japanese encephalitis virus

中图分类号:

R373.3
Q78

权力, 江爱民, 卢彦宗, 朱耐伟, 朱勇喆. 应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小窝蛋白1基因的神经细胞构建与功能鉴定[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2018, 29(5): 453-457.

QUAN Li, JIANG Ai-min, LU Yan-zong, ZHU Nai-wei, ZHU Yong-zhe. Constructing and functional analysis of knocking out CAV-1 gene by CRISPR/Cas9 system in neuron cells[J]. Chines Journal of Vector Biology and Control, 2018, 29(5): 453-457.

参考文献

[1] Misra UK,Kalita J. Overview:Japanese encephalitis[J]. Prog Neurobiol,2010,91(2):108-120. DOI:10.1016/j.pneurobio. 2010.01.008.
[2] 国家卫生和计划生育委员会疾病预防控制局. 2017年全国法定传染病疫情概况[EB/OL]. (2018-02-26)[2018-03-08]. http://www.nhfpc.gov.cn/jkj/s3578/201802/de926bdb046749abb7b0a8e23d929104.shtml.
[3] Schwencke C,Braun-Dullaeus RC,Wunderlich C,et al. Caveolae and caveolin in transmembrane signaling:implications for human disease[J]. Cardiovasc Res,2006,70(1):42-49. DOI:10.1016/j.cardiores.2005.11.029.
[4] Xu QQ,Cao MM,Song HY,et al. Caveolin-1-mediated Japanese encephalitis virus entry requires a two-step regulation of actin reorganization[J]. Future Microbiol,2016,11(10):1227-1248. DOI:10.2217/fmb-2016-0002.
[5] 赵德根,王建校,刘旭,等. 小干扰RNA的研究进展[J]. 现代生物医学进展,2014,14(4):792-794. DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2014.04.049.
[6] 陈瑶,刘青,邢微微,等. 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的RIP1稳定敲除细胞模型的构建及功能研究[J]. 军事医学,2017,41(2):96-100,105. DOI:10.7644/j.issn.1674-9960. 2017.02.004.
[7] Morgens DW,Deans RM,Li A,et al. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes[J]. Nat Biotechnol,2016,34(6):634-636. DOI:10.1038/nbt.3567.
[8] Zhu YZ,Xu QQ,Wu DG,et al. Japanese encephalitis virus enters rat neuroblastoma cells via a pH-dependent,dynamin and caveola-mediated endocytosis pathway[J]. J Virol,2012,86(24):13407-13422. DOI:10.1128/JVI.00903-12.
[9] Wang HX,Li MQ,Lee CM,et al. CRISPR/Cas9-based genome editing for disease modeling and therapy:Challenges and opportunities for nonviral delivery[J]. Chem Rev,2017,117(15):9874-9906. DOI:10.1021/acs.chemrev.6b00799.
[10] Fu YF,Foden JA,Khayter C,et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells[J]. Nat Biotechnol,2013,31(9):822-826. DOI:10.1038/nbt.2623.
[11] Cong L,Ran FA,Cox D,et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science,2013,339(6121):819-823. DOI:10.1126/science.1231143.
[12] Chen JS,Dagdas YS,Kleinstiver BP,et al. Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy[J]. Nature,2017,550(7676):407-410. DOI:10.1038/nature24268.
[13] Paquet D,Kwart D,Chen A,et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9[J]. Nature,2016,533(7601):125-129. DOI:10.1038/nature17664.
[14] 卢利莎,白杨,刘鑫,等. 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除MEIS2基因的HEK293T人胚肾细胞系[J]. 中国细胞生物学学报,2015,37(4):535-541. DOI:10.11844/cjcb.2015.04.0020.

[1]	薛志静, 王君, 宋秀平, 栗冬梅, 赵宁, 闫冬明, 梁文琴, 周敬祝, 王丹, 张瑞玲, 张忠, 刘起勇. 贵州省不同地区2018年蚊虫及蚊媒病毒调查[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2019, 30(3): 259-263.
[2]	潘虹, 高阳, 冯云, 韩茜, 张婧, 朱进, 李卫平, 李鸿斌, 范建华, 张海林. 云南省景洪市2015年蚊虫感染病毒状况调查[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2018, 29(4): 331-335.
[3]	杨培培, 李文娟, 程鹏, 郭秀霞, 王海防, 王怀位, 张崇星, 寇景轩, 刘丽娟, 公茂庆. 山东省南水北调沿线蚊类密度及流行性乙型脑炎病毒自然感染状况研究[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2016, 27(3): 232-234.
[4]	陈生林, 朱耐伟, 朱勇喆, 徐庆强, 彭浩然, 戚中田. 细胞膜胆固醇在流行性乙型脑炎病毒及肠道病毒71型感染人神经细胞中的作用[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2016, 27(3): 253-256.
[5]	袁明, 刘海博, 高艳青, 甘亚弟, 王大川. 北京首都第二机场建设前蚊媒监测结果分析[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2015, 26(6): 622-624.
[6]	李辞修, 施莽, 田俊华, 李明慧, 覃新程. 利用高通量测序技术检测流行性乙型脑炎病毒[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2015, 26(5): 439-442.
[7]	郑雅匀, 付士红, 唐晓燕, 李幸乐, 尚思远, 徐超, 梁国栋. 河南省新安县和息县2012年蚊传虫媒病毒调查[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2015, 26(2): 127-132.
[8]	高晓艳, 付士红, 邹文菁, 彭延, 刘红, 曹玉玺, 江永忠, 梁国栋. 湖北省部分地区2010年蚊传虫媒病毒调查[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2015, 26(2): 133-136.
[9]	田汶佳, 邓良利, 李鹏, 张伟, 刘竹, 马林. 实时荧光RT-PCR法快速检测三带喙库蚊中的流行性乙型脑炎病毒[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2015, 26(2): 137-140.
[10]	李铭华, 付士红, 姜红月, 陈维欣, 唐松, 施勇, 梁国栋. 江西省流行性乙型脑炎病毒的分离与鉴定[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2012, 23(5): 388-390,394.
[11]	郭晓芳, 王丕玉, 曾旭灿, 赵秋敏, 周传玲, 龚道方, 李佳, 王海波, 董利民, 周红宁, 张久松. 云南省澜沧江流域蚊虫流行性乙型脑炎病毒分子特征分析[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2012, 23(5): 391-394.
[12]	贾慧丽, 李铭华, 付士红, 王俊, 张永根, 胡万富, 梁国栋. 2010年安徽省蚊虫标本分离到基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2012, 23(5): 395-397.
[13]	王环宇, 付士红, 何英, 闵继光, 潘晓玲, 梁国栋. 两种基因型流行性乙型脑炎病毒在上海市共同流行[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2012, 23(5): 398-401.
[14]	冯云, 陈卫武, 杨卫红, 章域震, 杨杜鹃, 刘芬, 张娟, 王丕玉, 白鹏飞, 窦友剑, 李继辉, 张海林. 云南省弥勒县2009年蚊媒病毒分离和鉴定[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2012, 23(5): 402-405.
[15]	唐承军, 付士红, 张海林, 范建华, 杨卫红, 章域震, 吕志, 李园园, 李鸿斌, 朱进, 王宇, 陶伽伶, 李丽华, 白卫荣, 查冰, 王丕玉, 梁国栋. 云南省西双版纳地区2011年蚊虫及虫媒病毒调查[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2012, 23(5): 410-412,416.

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